Soutenance de thèse de Matthias HOFER

Les techniques de microscopie non-linéaire et de fluorescence sont de nos jours largement utilisées pour mieux comprendre les processus biologiques des tissus, car elles permettent notamment de combiner spécificité chimique et résolution submicronique. Cependant, leurs performances se trouvent en pratique altérées par la diffusion de la lumière. Celle-ci diminue le contraste des images, les rendant inexploitables au-delà d’une certaine profondeur, qui est généralement reliée au libre parcours moyen du milieu dans lequel l’onde se propage. Dans cette thèse, nous avons développé des approches visant à utiliser ces techniques de microscopie à de plus amples profondeurs. Pour retrouver un objet fluorescent derrière un milieu diffusant, les corrélations de ce milieu peuvent être exploitées. Nous avons utilisé cette technique de corrélation des speckles sur un microscope plein champ conventionnel et discuté des modalités d’imagerie ainsi que des limitations de l’effet mémoire spatial et spectral. Nous présentons une nouvelle technique de traitement d’image combinée à un nouvel algorithme de « phase-retrieval » afin de reconstruire l’objet. Cependant, la microscopie de fluorescence ne présente pas de sectionnement optique intrinsèque, contrairement aux techniques d’imagerie non-linéaire. Nous avons donc également étudié le comportement de ces dernières en milieu diffusant. Nous avons notamment utilisé de méthodes fondées sur la matrice de transmission et le façonnage de front d’onde (« wavefront shaping ») pour focaliser des impulsions courtes laser au travers de milieux biologiques hautement diffusants, comme des coupes de moelle épinière de souris. Nous avons montré que, même dans des tissus de plus d’un millimètre d’épaisseur, des impulsions laser de 200 fs restaient suffisamment courts pour générer des signaux de seconde-harmonique. De plus, en utilisant les corrélations spatiales de la matrice de transmission, nous avons pu scanner un focus de façon homogène sur un champ de vue de plusieurs dizaines de micromètres. Enfin, nous avons étudié la possibilité de générer un signal CARS (Coherent anti-Stokes Raman Scattering) au travers d’un milieu diffusant. Le contraste CARS permet de sonder des vibrations moléculaires spécifiques sans marqueur fluorescent. Cependant, sa génération au travers d’un milieu diffusant est difficile, puisqu’elle nécessite de focaliser deux fréquences distinctes au travers d’un même milieu diffusant. Dans un premier temps, nous avons étudié les propriétés spectrales de propagation dans les milieux diffusant et leurs corrélations spatiales : Celles-ci permettent de définir une géométrie optique optimale pour refocaliser des longueurs d’ondes distinctes. Dans un second temps, l’étude des corrélations spectrales du milieu nous a permis de mettre au point des stratégies de wavefront shaping à SLM unique. Celles-ci ont abouti à la génération de signal CARS à des profondeurs où la microscopie CARS classique ne peut être conduite.

Fluorescence and nonlinear microscopy techniques are today widely used to form an understanding of biological processes in tissues, by specifically resolving sub micrometer structures. However, those microscopy techniques are impaired by light scattering and therefore contrasted images can only be generated until a certain depth which is typically related to the scattering mean free path of the medium. In this PhD work, we have developed approaches that allow reaching larger depths. In fluorescence imaging, correlations of a thin scattering medium can be exploited to recover fluorescent objects that are hidden behind it. We have transferred this speckle correlation technique to a conventional wide field microscope discussing imaging modalities, spatial and spectral memory effect limitations. We present a novel image processing technique combined with a novel phase retrieval algorithm for the reconstruction of the hidden object. To circumvent the lack of 3D sectioning in fluorescence microscopy, we have also studied nonlinear imaging approaches in scattering media. We have used in particular the transmission matrix (TM) and wavefront shaping as means to refocus short pulses through highly scattering biological tissues such as mouse spinal cord slices. We found that even through tissues thicker than one millimeter, 200 fs-laser pulses remain short and able to generate second harmonic signals. Moreover, we have demonstrated homogeneous focus scanning over tens of micrometer field of views, deploying strategies that use the TM spatial correlations properties. At last, we have studied the possibility to generate Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) behind a scattering medium, a contrast which permits to probe specific molecular vibrations without fluorescence labels. However, its control in scattering media is complex since two distinct frequencies are necessary to generate CARS. We have first studied the spectral propagation properties of scattering media and in particular their spatial correlations, which permit to define an optimal optical geometry for refocusing different wavelengths. Exploiting furthermore spectral correlations properties of the medium, we have demonstrated, with a single SLM, wavefront shaping strategies able to generate CARS signals at tissue thicknesses where conventional CARS microscopy fails.