Soutenance de thèse de Caio VAZ RIMOLI

Les filaments d'actine sont des éléments structurels clés qui affectent le comportement et la fonction des cellules. Bien qu'ils soient largement étudiés, des questions restent ouvertes sur la manière dont leur organisation à l'échelle nanométrique influence la morphologie et les processus cellulaires. Un assemblage d'actine important est celui des fibres de stress, qui sont des faisceaux supramoléculaires constitués de filaments de F-actine et de réticulants qui jouent un rôle important dans l'adhésion et la motilité des cellules. Les fibres de stress de l'actine supportent des forces cellulaires et peuvent être subdivisées en différentes catégories, en particulier celles qui sont contractiles et celles qui ne le sont pas. La manière dont les filaments d'actine sont organisés en différentes catégories de fibres de stress à l'échelle nanométrique est un sujet encore mal compris. À cette fin, les techniques de microscopie à fluorescence polarisée (PFM) peuvent être très utiles dès lors qu'elles peuvent fournir des informations quantitatives de sous-diffraction de l'organisation moléculaire avec une grande spécificité dans les cellules. Dans cette thèse, nous construisons un système de microscope optique capable de réaliser deux méthodes PFM différentes pour étudier l'organisation des filaments d'actine à l'échelle nanométrique. La première méthode PFM, est une réplique d'un système précédemment construit dans notre groupe, qui est une technique de résolution de polarisation moyenne d'ensemble. Cette dernière utilise une rotation rapide de la polarisation effectuée par une cellule de Pockels placée dans le trajet d'excitation, et un balayage confocal parallèle multi-focal pour une imagerie rapide (disque rotatif). La seconde méthode PFM est une nouvelle méthode de super-résolution polarisée que nous avons appelée 4polar-dSTORM. Cette méthode est basée sur la méthode de microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) qui divise les signaux de fluorescence monomoléculaire en 4 canaux de polarisation projetés. Avec ce dernier, nous avons pu mesurer chaque orientation moyenne d'un fluorophore unique (le long d'un filament) indépendamment de l'ondulation du fluorophore (fluctuations angulaires). Grâce à cela, nous avons pu effectuer la première quantification 2D non biaisée de l'ordre statique du filament d'actine à l'échelle nanométrique avec une résolution optique allant jusqu'à environ 20 nm. Grâce à ces techniques, nous avons pu conclure que l'organisation des filaments d'actine est assez constante (avec des écarts angulaires d'environ 20° à 30°) le long de toutes les catégories de fibres de stress et qu'il s'agit de structures très stables en cas de perturbation de la contractilité ou de stimuli. Il est intéressant de noter que, puisque la méthode 4polar-dSTORM est basée sur une seule molécule, d'autres structures complexes d'actine telles que des maillages de filaments d'actine très denses à l'échelle nanométrique (par exemple dans les lamellipodes) pourraient être étudiées, ce qui illustre le potentiel de la méthode pour étudier des organisations inconnues.

Actin filaments are key structural building blocks that affects cell behavior and function. Although they are extensively studied, open questions still arise on how their organization at the nanoscale influences cell morphology and processes. An important actin assembly is stress fibers, which are supramolecular bundles made of F-actin filaments and crosslinkers that have an important role in cell adhesion and motility. Actin stress fibers bear cellular forces, and can be subdivided into different categories, in particular those which are contractile and those which are not. How actin filaments are organized in different stress fiber categories at the nanoscale is a topic still not well understood. To that end, polarized fluorescence microscopy (PFM) techniques can be very useful once they can provide subdiffraction quantitative information of the molecular organization with high specificity in cells. In this thesis, we build up an optical microscope system capable of performing two different PFMs methods to study the organization of actin filaments at the nanoscale. The first PFM method, is a replica of a previously built system in our group, which is an ensemble averaged polarization resolved technique. The latter uses a fast polarization rotation performed by a Pockels cell placed in the excitation path, and a multi-focus parallel confocal scanning for fast imaging (spinning disk). The second PFM method is a novel polarized super-resolution method that we named 4polar-dSTORM. The method is based on direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) method that splits single-molecule fluorescence signals into 4 projected polarization channels. With the latter, we were able to measure each single-fluorophore mean orientation (along a bundle) independently of the fluorophore wobbling (angular fluctuations). Thanks to that, we were able to perform the first 2D unbiased quantification of the actin filament static order at the nanoscale with an optical resolution up to approximately 20nm. With these techniques, we were able to conclude that actin filament organization is quite constant (within angular deviations of about 20° to 30°) along all stress fiber categories and they are highly stable structures upon contractility perturbation or stimuli. Interestingly, since 4polar-dSTORM is a single-molecule based method, other actin complex structures such as very dense nanoscale actin filament meshworks (e.g., in lamellipodia) could be studied, illustrating the potential of the method to investigate unknown organizations.