Soutenance de thèse de Abbas MOHAMAD ALI

L'exposition des bactéries aux métaux dans l'environnement est un sujet de recherche important en microbiologie environnementale. Les métaux peuvent être présents naturellement dans l'environnement, mais leur concentration peut être augmentée en raison de l'activité humaine. L'uranium, un métal radioactif, peut être toxique pour les bactéries ainsi que pour l'homme. Certaines bactéries sont cependant capables de tolérer l'uranium grâce à leur capacité à accumuler et à transformer les métaux. L’étude des mécanismes d’interaction des bactéries avec les métaux s’avère avoir un intérêt pour la santé publique et dans le développement des stratégies de bioremédiation. Nos études antérieures des mécanismes de tolérance à l’uranium chez trois souches de Microbacterium a permis de découvrir la protéine UipA (Uranium induced protein A), une protéine spécifique du genre Microbacterium et dont l’abondance est fortement stimulée en réponse à l’uranyle. UipA a une forte affinité pour l’uranyle (UO22+) et pour le Fe3+. En amont du gène uipA se trouvent deux gènes codants pour les protéines UipRS, homologues du système à deux composants CzcRS connu pour être impliqué dans la tolérance aux métaux chez diverses bactéries. L'ensemble de ces données suggère que la protéine UipA, associée au système à deux composants UipRS, est impliquée dans la tolérance à l'uranium et dans l’homéostasie du fer chez ces bactéries. Afin de caractériser la structure et la fonction du système UipRSA, l’étude de chacune de ces protéines a été entreprise. Nous avons d’abord étudié le mode d’assemblage de la protéine UipA. Dans un premier temps, l’étude de la topologie par des approches in silico et in vivo a permis de délimiter les différents domaines de la protéine. En revanche, les différentes approches in vitro et in vivo employées pour l’étude de la multimérisation de UipA ne permettent pas de conclure formellement sur cette question. Ensuite, nous avons poursuivi l’étude des sites d’interaction de UipA avec les métaux. En utilisant la cristallographie, nous avons mis en évidence un site d’interaction de UipA avec le fer sous forme de Fe3O. Ce site, nommé U3 avait été caractérisé auparavant comme un des sites de fixation de l’uranyle. Les approches de spectrométrie de masse native et de fluorimétrie ont permis de confirmer la fixation de fer sous forme de Fe3O par UipA, avec deux sites de fixation de ce cluster sur la protéine détectés. La caractérisation des protéines UipS et UipR a été abordée par des approches in silico (analyse des séquences et modélisation des structures). Ces protéines sont prédites pour former un système à deux composants formé d’un senseur histidine kinase (UipS) et d’un régulateur de réponse (UipR). Des approches in vivo ont permis de déterminer que UipS possède 2 segments transmembranaires et forme des homodimères. Les résultats obtenus en spectrométrie de masse et fluorimétrie montrent que le domaine senseur de UipS est affin et spécifique de l’UO22+ et du Fe3+ et possèdent deux sites métalliques. Les analyses in silico indique que la protéine UipR appartient à la famille WalR-Like et les résultats préliminaires de retard sur gel indiquent une interaction de UipR avec la région d’ADN située en amont du gène uipA. L’ensemble de ces résultats permet de proposer que les protéines UipRSA forment un système de détection et de réponse à l’uranium et au fer chez Microbacterium. Le système à deux composants UipSR permettrait de coupler la détection de ces deux métaux à l’expression du gène uipA, via le transfert du signal de la protéine UipS au régulateur de réponse UipR. La surproduction de UipA permettrait aux bactéries une séquestration extracellulaire de l’uranium et le stockage du fer.

The exposure of bacteria to metals in the environment is an important research topic in environmental microbiology. Metals may be naturally present in the environment, but their concentration can be increased due to human activity. Uranium, a radioactive metal, can be toxic to both bacteria and humans. However, some bacteria are capable of tolerating uranium due to their ability to accumulate and transform metals. The study of the mechanisms of bacteria-metal interaction is of interest for public health and in the development of bioremediation strategies. Previous studies of uranium tolerance mechanisms in three strains of Microbacterium led to the discovery of the protein UipA (Uranium-induced protein A), a Microbacterium-specific protein whose abundance is strongly stimulated in response to uranyl. UipA has a high affinity for uranyl (UO22+) and Fe3+. Upstream of the uipA gene are two genes encoding the UipRS proteins, homologous to the two-component system CzcRS known to be involved in metal tolerance in various bacteria. All of these data suggest that UipA, associated with the two-component system UipRS, is involved in uranium tolerance and iron homeostasis in these bacteria. To characterize the structure and function of the UipRSA system, the study of each of these proteins was undertaken. First, we studied the assembly mode of the UipA protein. Initially, the study of topology using in silico and in vivo approaches delimited the different domains of the protein. However, the various in vitro and in vivo approaches employed to study UipA oligomerization do not allow us to draw formal conclusions on this issue. Then, we continued the study of UipA interaction sites with metals. Using crystallography, we identified an interaction site of UipA with iron in the form of Fe3O. This site, named U3, had previously been characterized as one of the uranyl-binding sites. Native mass spectrometry and fluorimetry approaches confirmed the binding of Fe3O by UipA, with two cluster-binding sites on the protein detected. The characterization of UipS and UipR proteins was addressed by in silico approaches (sequence analysis and structure modeling). These proteins are predicted to form a two-component system consisting of a histidine kinase sensor (UipS) and a response regulator (UipR). In vivo approaches proved that UipS has 2 transmembrane segments and forms homodimers. The results obtained in mass spectrometry and fluorimetry showed that the UipS sensor domain is specific for UO22+ and Fe3+ and has two metal-binding sites. In silico analyses indicate that the UipR protein belongs to the WalR-Like family, and preliminary gel retardation results indicate an interaction of UipR with the DNA region upstream of the uipA gene. All these results suggest that the UipRSA proteins form a detection and response system to uranium and iron in Microbacterium. The two-component system UipSR would allow coupling the detection of these two metals to the expression of the uipA gene via the transfer of the signal from the UipS protein to the response regulator UipR. The overproduction of UipA would allow the bacteria to perform extracellular uranium sequestration and iron storage.